长期锻炼对癌症生存者氧化应激状态的影响
王人卫1 汪继兵1 朱为模4 范丽玲1 李擎2 袁正平3 卢慧娟3 周佩3
1．上海体育学院运动科学学院 2．上海市徐汇区中心医院
3．上海市癌症康复学校 4．美国伊利诺伊斯大学
摘要：目的 观察长期锻炼对癌症长期生存者氧化应激状态的影响。方法 从上海市癌症康复学校4千余名会员中选择患癌症后生存10年以上并坚持自控锻炼10年以上者30人为锻炼组，不参加自控锻炼但年龄、性别、所患癌症类型、治疗方法等与锻炼组一对一匹配的30人为对照组。采用癌症病史问卷调查所有受试者既往详细病史，安静状态下测定其血清SOD、GSH-Px、T-AOC和MDA含量；采用K4b2测试20名锻炼者一次完整自控锻炼过程中的VO2和HR。结果 锻炼组血清SOD、T-AOC、MDA水平显著高于对照组（P<0.01，P<0.05，P<0.01），GSH-Px水平与对照组相比无统计学差异（P>0.05）。预备势时VO2为6.13±1.53 ml/min/kg，HR为85.72±9.52 bpm，在主要部分自然走阶段，VO2为14.10±2.17ml/min/kg，HR为103.87±10.61bpm，收势时的VO2为8.26±2.55 ml/min/kg，HR为90.74±6.96 bpm。结论 长期规律锻炼者血清SOD、T-AOC活性和MDA含量均高于不锻炼者，提示锻炼者体内氧化应激处于较高代谢速率的动态平衡状态。
关键词：锻炼；癌症长期生存；氧化应激；自由基
在癌症发生、发展过程中，机体的氧化应激状态发挥着重要作用。氧化应激是指机体内氧化还原之间的相对水平，是经过长期进化取得的自我更新和保护的重要手段。健康的机体通过产生自由基以保持一定的氧化应激水平，用来杀灭清除外源物，清除或控制老化、变异的细胞（包括肿瘤细胞），此时氧化应激的作用是积极的，但过量的自由基会造成机体内氧化剂和抗氧化剂的不平衡，使氧化应激水平大幅升高，与多种疾病的发生与发展有关<1>。但目前针对癌症患者氧化应激方面的临床研究较多，而对癌症长期生存的研究较少，特别是体育锻炼对癌症长期生存者氧化应激状态的影响及其与癌症长期生存间的关系尚未见报道。本研究的锻炼形式为自控锻炼，自控锻炼是在太极拳、五禽戏、导引养生和步行等传统体育锻炼的基础上，结合癌症的特点总结形成，作为一种锻炼方式，主张癌症患者在进行临床治疗的同时采用这种锻炼作为辅助康复途径，不影响临床治疗和医嘱要求，由于它简便易学，动静相兼，因此被癌症患者广泛接受作为体育康复的一种手段。以往有关自控锻炼对癌症生存者氧化应激状态的影响未见研究报道，因此本研究观察长期自控锻炼对癌症生存者氧化应激状态的可能影响，拟探讨其在癌症康复与长期生存中的可能作用及其机制。
1 研究对象与方法
1.1 研究对象与分组
为尽可能明确锻炼与氧化应激状态间的联系，需充分控制锻炼之外其他混杂因素的影响，这无疑是非常困难的，借鉴流行病学匹配病例对照研究设计，使参加和不参加自控锻炼的两组在人口统计学变量、癌症类型、荷瘤后生存时间、治疗方式等方面尽可能匹配较好，避免年龄、性别、癌症类型、临床治疗、癌症分期等对癌症转归有重要预后价值变量的干扰。以确诊癌症后生存10年以上，坚持自控锻炼10年以上且至今仍在锻炼为基本条件，从上海市癌症康复学校20000余名会员中选择30人为锻炼组，锻炼组除自控锻炼外不参加其他规律性锻炼。对照组不参加自控锻炼、无规律锻炼习惯，并且在年龄、性别、癌症类型、确诊癌症后的生存时间、治疗方案等方面与锻炼组一对一匹配较好，对照组每名受试者和锻炼组每名受试者按照匹配条件1：1配对，共30对，60人。
匹配条件：1）性别，完全配对；2）年龄，以锻炼组每个受试者年龄±3岁为参照，逐个选择与之配对的对照组受试者；3）依据病历资料，癌症类型以原发部位和病理类型确定，原发部位只准确到器官，不区别对待左右侧乳腺癌、卵巢癌、肺癌，肺癌、肝癌不精确到肺叶和肝叶，诊断时发现两个部位原发癌症的选择第一诊断；4）患癌症后生存时间，以锻炼组每个受试者生存时间±5年为参照，逐个选择与之配对的对照组受试者；5）治疗方案，要求在手术、化疗和放疗间的组合上基本相同；6）目前因与癌症无关疾病、细菌感染等临时治疗需要而服用的药物不作为配对条件，但在其停服后至少两周才进行实验测试；7）受试者来自上海，因配对困难，个别受试者来自江苏无锡；8）考虑到锻炼和饮食习惯存在关联，锻炼效应如能量消耗增加可能改变其饮食摄入，故营养状况不作为匹配条件。
受试者的排除条件：1）目前发现新生原发性癌症病灶，局部癌症复发、远处转移；2）严重的活动性、进展期疾病，尚处于治疗中；3）因身体限制不能完成测试；4）不同意配合测试。
不足人数按照匹配条件和排除条件再次选取，经过选择后的受试者共60人，本测试还需最近两周未服用抗氧化药物（如VitE）或外用抗氧化剂(如SOD及同类化妆品)。研究对象的构成情况见表1。
表1 研究对象配对情况 （30对，共60名）
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锻炼组
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对照组
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男 女
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男
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女
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胃癌
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4
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4
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4
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4
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结肠直肠癌
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4
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2
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4
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2
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乳腺癌
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0
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6
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0
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6
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肝癌
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3
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0
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3
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0
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卵巢癌
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0
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2
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0
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2
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上颌窦癌
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0
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1
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0
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1
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鼻咽癌
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1
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0
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1
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0
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前列腺癌
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1
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0
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1
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0
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胰腺癌
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1
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0
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1
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0
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甲状腺癌
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0
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1
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0
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1
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表2为研究对象的基本情况，可以看出，经过选择配对，锻炼组和对照组在年龄、身高、体重、生存时间方面没有显著性差异，具有可比性。
表2 研究对象基本情况（30对，共60名）
组别
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年龄（yr）
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身高（cm）
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体重(kg)
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生存时间（yr）
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锻炼组30人
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61.78±7.38
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163.88±6.52
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62.92±10.82
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16.87±5.17
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对照组30人
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61.08±7.57
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164.14±7.24
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63.31±9.59
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15.79±4.26
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1.2 参与测试的适宜性确定
测定所有受试者的身高、体重、血压、脉搏，进行一般体格检查，填写Thomas S的PAR-Q（《体育运动适宜问卷表》）<2>，根据受试者对PAR-Q各条目的选择结果，判断受试者参加体育运动的适宜性，通过癌症病史问卷详细调查以上匹配条件的实际匹配情况和基本病史资料；所有受试者均自愿参加本研究，签署知情同意书，由医生综合病史资料、运动适宜性和体格检查的总体情况签署医学批准书。
1.3 癌症病史和健康状况的调查
癌症病史（Cancer History）问卷来自C. M. Schneider<3>，内容包括一般情况、癌症类型、确诊日期、具体位置、症状表现、手术情况、术后治疗、用药情况、并发症、住院史、现病史、家族病史等方面，用于了解受试者病史背景以利于结合测试指标进行分析。问卷由经过培训的专人一对一地向受试者调查获得，特定情况按研究要求进行结构性访谈。
1.4 自控锻炼过程中的摄氧量（VO2）和心率（HR）测定
1.4.1 自控锻炼的方式和特点
自控锻炼的形式简单，以动为主，锻炼者根据自身体力状况选择可以完成的形式、各部分的时间、每次练习总时间和每日练习的次数进行锻炼，不影响临床治疗和医嘱要求，癌症长期生存者日常进行的自控锻炼一般仅由预备势、自然走和收势组成，锻炼时间1小时左右，每日1-3次。此前，Weimo Zhu测定了自控锻炼各构成部分的能量消耗，建立了各部分相应的MET值<4>，这些MET值为不同健身运动项目之间强度的比较提供了依据。我们为定量研究锻炼的摄氧量与自由基代谢指标间的关系，测定了自控锻炼过程中的VO2和HR变化。
1.4.2 测试对象选择
从30名多年自控锻炼者中选择20名自愿者进行VO2和HR测试，其中男性10名，女性10名，包括胃癌5例，乳癌3例，肝癌3例，结肠直肠癌3例，卵巢癌2例，甲状腺癌、前列腺癌，胰腺癌、鼻咽癌各1例。20名受试者的具体情况见表3。
表3 锻炼过程中VO2和HR测试的受试者基本情况（20名）
年龄（yr） 身高（cm） 体重(kg) 癌症后生存时间（yr） 锻炼时间（yr）
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60.87±6.76 164.12±6.52 63.29±10.53 17.08±5.06 15.34±6.29
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1.4.3 锻炼过程中的VO2和HR的测定
要求受试者在测试前12小时不进行剧烈运动，并保证至少2小时之内未进食。采用便携式运动心肺功能测试系统K4b2（COSMED公司，意大利），实时采集锻炼者进行一次完整自控锻炼过程中的VO2和HR。K4b2采用一口气接一口气分析方法进行测定，在每次测试前先预热45分钟，并按运动心肺功能测试系统说明书依次进行室内空气（环境空气）校准、参考气体（O2 16%，CO2 5%，余为N2）校准、气体延迟校准和涡轮流速感应器校准的程序进行校准，以确保测试的准确性，然后输入受试者的身高、体重、性别、年龄等背景资料和环境参数。测试在安静、温度18-24℃，相对湿度45％左右的环境中进行。受试者佩戴好POLAR表和K4b2，经过适应恢复到安静心率，确认对其锻炼没有影响后开始正式测试，观察记录各部分准确的起始和结束时间。测试后的数据经K4b2管理软件平滑处理后转为EXCEL格式保存。
1.5 血样采集及处理
所有受试者采血前12小时内不进行剧烈运动，于正常作息的早晨空腹同一时间段采肘静脉血3ml，置入不加任何试剂的试管内，2小时内以3000r/min离心15分钟，分离出的血清立刻置-80℃冰箱冷冻保存备测。
1.6 血清指标测定
血清超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定采用黄嘌呤氧化法。谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力测定采用二硫代双硝基苯甲酸直接法（DTNB）。总抗氧化能力（T-AOC）测定采用菲罗啉法。丙二醛（MDA）含量测定采用硫代巴比妥酸法（TBA）。所有试剂为南京建成生物工程研究所提供，严格按照说明书操作。
1.7 数据处理
各项指标采用SPSS 11.0统计软件处理，所有数据以平均数±标准差表示。组间比较采用配对t检验，显著性水平为P<0.05，非常显著性水平为P<0.01。
2 结果
2.1 血清SOD、GSH-Px、T-AOC活性和MDA含量
表4 受试者血清SOD、GSH-Px、T-AOC活性和MDA含量
组别
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SOD (U/ml)
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GSH-Px(U)
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T-AOC U/ml
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MDA(nmol/ml)
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锻炼组（30人）
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85.46±10.29**
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256.39±29.03
|
22.63±4.46*
|
5.50±0.93**
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对照组（30人）
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77.79±7.49
|
273.03±61.03
|
19.55±2.81
|
4.73±0.95
|
*表示与对照组相比P<0.05，**表示与对照组相比P<0.01。
如表4所示，锻炼组血清SOD活力高于对照组，有高度显著性差异（P<0.01）、T-AOC含量高于对照组，有显著性差异（P<0.05），锻炼组GSH-Px活力均值低于对照组但无统计学差异。锻炼组MDA含量高于对照组，有高度显著性差异（P<0.01）。
2.2 锻炼过程中的VO2、VO2/Kg和HR
表5 锻炼时的VO2、VO2/Kg和HR（20名）
锻炼阶段
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VO2（ml/min）
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VO2/Kg（ml/min/kg）
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HR（bpm）
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预备势
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384.45±113.35
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6.13±1.53
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85.72±9.52
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自然走
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913.06±190.47
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14.10±2.17
|
103.87±10.61
|
收势
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535.11±189.19
|
8.26±2.55
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90.74±6.96
|
表5显示了锻炼中预备势、自然走和收势三部分的VO2、VO2/Kg和HR，反映了自控锻炼过程中的摄氧量和相对摄氧量的变化特点，在主要部分自然走阶段，可见VO2和VO2/Kg明显升高，分别为913.06±190.47 ml/min和14.10±2.17 ml/min/kg，接近预备势VO2和VO2/Kg的2.4倍，收势VO2和VO2/Kg的1.6倍，三个阶段VO2/Kg与VO2的变化幅度较为一致，HR的变化也反映了锻炼过程中的强度变化特点。收势时的VO2、HR仍保持在高于预备势的水平。
3 分析与讨论
3.1 锻炼对癌症长期生存者氧化应激状态的影响
正常代谢产生的自由基参与新陈代谢、贮能、转化排废和识别、破坏、消除癌细胞等生理作用，但机体内也存在自由基清除系统，它们对清除自由基、保护细胞及机体具有重要作用，包括酶系统和非酶系统，前者主要有超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等，后者主要有谷胱甘肽、VitC、VitE等，若机体的自由基清除能力下降或自由基生成过度，则造成氧化应激水平过高而损伤组织，参与多种疾病的发生与发展<5>。早在1979年Oberley等就提出，癌变的自由基机制在于氧自由基含量的上升和细胞中的SOD活性显著下降，自由基产生与消除间的相对平衡被破坏而引起细胞癌变<6>。自由基可作用于DNA，启动分裂，并最终影响癌基因表达而引发癌变，很多实验也证明自由基在诱癌、促癌及抗癌等方面都有重要作用<7>。
自由基的产生和清除是氧化应激的两个方面，锻炼对机体氧化应激状态的影响因锻炼方式、强度、组织类型的不同而存在差异，对人和动物的大量研究认为激烈的身体活动可能诱导若干组织中的氧化与抗氧化防御失衡，偏向于过多的活性氧（ROS）的生成<8>。Alessio的研究提示耗氧量的增加可能增加自由基的产生，运动类型、持续时间、运动强度、个体的状态等因素均可能影响自由基生物标记物活性，他的近期研究则提示力竭运动和静力练习均增加氧化应激水平，但耗氧量反映的运动强度不是运动诱导氧化应激的唯一机制<9>。目前研究认为，运动可引起内源性自由基的增多，即运动具有提高体内自由基水平的倾向，自由基产生增加可能是运动引起的氧耗增加的必然结果。丙二醛（MDA）是脂质过氧化的产物，体内MDA含量可用于间接反映体内自由基水平。本研究锻炼组MDA高于对照组，由于测试时要求正常作息，锻炼组每日坚持自控锻炼，而对照组不参加自控锻炼和其他规律锻炼，因此，MDA反映体内自由基水平的增高可能正是每日锻炼的结果，反映了锻炼组体内自由基水平的常态。
关于有规律的身体活动和长期锻炼对机体自由基清除能力的影响的研究结果并不一致，长期运动可提高机体的抗氧化能力已得到研究证实<10>。因为多年的追踪研究有很多困难，造成长期运动对氧化应激状态累积影响的研究缺乏。我们发现，锻炼组SOD活性、T-AOC显著高于对照组，由于SOD是能特异性的清除超氧阴离子自由基的抗氧化酶，而且T-AOC高低也可充分反映机体抗氧化防御能力，这一测定结果说明多年自控锻炼提高了体内自由基清除酶的水平，增强了清除自由基的能力，与Di Massimo的研究一致，他评价了坐式生活者进行20周中等强度规律运动的效果，结果血浆T-AOC、SOD活性升高，提示中等强度的规律运动诱导了抗氧化防御能力的提高<11>。Elosua对17名健康男女进行16周有氧训练，观察到有氧训练诱导了GSH-Px的升高，认为规律的身体活动增加了内源性抗氧化剂活性，不同的运动时间和强度启动抗氧化剂的阈值和幅度可能不同<12>。Karolkiewicz对健康绝经妇女参加8周中等强度的功率自行车练习的研究发现血浆T-AOC和红细胞GSH-Px浓度显著性增加，提示8周有氧训练改善了氧化和抗氧化间的平衡<13>。我们研究发现，锻炼组GSH-Px均值低于对照组但没有统计学差异，这一结果是否与样本是血清有关尚不清楚，因为GSH-Px主要存在于细胞内，肝、红细胞活性最高，肌肉最低，属于过氧化物酶类，它和过氧化氢酶都可清除生物体内产生的过氧化氢（H2O2），我们测定的是分离红细胞后的血清，与红细胞内和其他组织中的GSH-Px是否一致？如果不一致，则表明长期锻炼对抗氧化酶的影响可能存在组织差异性，提示今后进行氧化应激状态的研究应考虑这种组织的差异；这一结果也可能是因为锻炼组产生的自由基高于对照组，并因清除较多自由基的需要而特异地消耗了更多的GSH-Px，确切的原因尚需进一步研究。
3.2 锻炼的负荷特点与氧化应激状态间的联系
为进一步探讨上述研究结果的原因，我们测定了锻炼过程中的VO2和HR，以反映自控锻炼的负荷特点与氧化应激状态间的联系，也便于今后不同研究结果的相互比较。气体代谢测试结果显示，预备势时的VO2和VO2/Kg分别为384.45 ml/min和6.13 ml/min/kg，这与其特点相符，预备势要求“松静站立”，身体和精神处于放松状态，只有上肢缓慢而简单的动作，因此VO2、VO2/Kg和HR值反映的预备势的运动强度很小。在主要部分自然走阶段，VO2 和VO2/Kg分别为913.06 ml/min和14.10 ml/min/kg，平均心率103.87 bpm，根据VO2max的年龄和性别变化特点<14,15>，此值表明自然走属中等强度有氧运动。自然走形式虽然类似行走，但要求在行走中附加上肢的摆动和呼吸的配合，这可能是其VO2和HR所反映的负荷特点与日常行走和散步不同的原因。收势时的VO2和HR仍保持在高于预备势的水平，在自控锻炼中的作用相当于整理活动，日常锻炼过程中其时间一般较短，因此尚不足以使机体恢复到接近安静和预备势的水平。上述结果结合自由基代谢指标的测定值，可以认为长期这种强度的规律有氧锻炼提高了SOD、T-AOC活性，机体抗氧化损伤能力高于无规律锻炼习惯者。目前以VO2定量研究运动强度对自由基产生和抗氧化酶影响的研究很少。Criswell观察以80-95%VO2max强度间歇训练和以70%VO2max强度连续训练12周的鼠骨骼肌氧化和抗氧化酶活性，发现间歇训练组和连续训练组SOD活性均高于对照组<16>。Lovlin提出短时间亚极量运动（例如小于70% VO2max）抑制自由基产生和脂质过氧化作用<17>，但他并未注意到内源性抗氧化剂的改变，并且这种改变与自由基的产生可能并不同步。因此需要更多的研究明确VO2反映的运动强度与抗氧化酶活性和自由基生成的对应关系。我们的这一结果为癌症生存者锻炼方式和强度的选择提供了参考。
3.3 长期锻炼对氧化应激状态的累积影响与癌症生存间的联系
研究发现在癌症发展的不同阶段自由基浓度并不稳定，癌症早期自由基浓度较高并随病情进展上升，到癌症晚期则处于较低水平，自由基浓度不同对肿瘤细胞发挥着不同作用，例如低浓度的过氧化氢（H2O2）能促进肿瘤细胞增殖，中等浓度诱导肿瘤细胞发生凋亡，而高浓度则引起细胞死亡<18>。而且，ROS同时参加Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号途径和p38 MAPK途径，Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号系统与肿瘤生成有关，而p38 MAPK途径促成肿瘤抑制，两者功能相反，因此，ROS不完全是致癌因子或抑癌因子，可能有促进癌症和抑制癌症的双重作用<7>。关于肿瘤的临床研究却认为，低自由基水平有利于减少癌症风险，改善癌症转归，从这点来分析，运动对自由基产生的影响与减少癌症发生风险、有利癌症生存之间存在矛盾。已往的研究并未对癌症长期生存者的氧化应激状态进行观察，因而锻炼对于癌症长期生存的意义可能并不取决于自由基水平，而主要在于对抗氧化能力的影响方面。
锻炼组MDA、SOD和T-AOC水平均高于对照组，这一结果说明锻炼组自由基的生成和清除速率均高于对照组，只是代谢速率有所提高，但保持在一种动态平衡状态。有研究认为运动促进人体对氧化应激的适应是通过特定的信号传导途径调节抗氧化酶对ROS的反应来实现的<19>。受过训练者能更好地耐受中等强度运动诱导的自由基活动，对自由基的适应能力更强<8>。Kruk通过对大量的流行病学资料的研究和所有潜在因素的评估，说明身体活动与癌症联系的生物学机制通过自由基清除系统改变自由基对身体的损害是极为重要的一方面<20>。氧化应激窗口期理论也认为，氧化应激是机体内一种不可避免的状态，存在正常、亚健康和临界致病三个水平，不对机体产生器质性损害的最长时间区间为氧化应激窗口期，如果在此阶段有效消除自由基，降低氧化应激水平，能够有效减少自由基对特定遗传物质DNA或RNA、蛋白质、脂类等重要生命物质的结构修饰，减少DNA或RNA变异而造成的组织病变（如肿瘤细胞）的发生，如果本研究能部分解释并支持这一理论，可部分解释“带癌生存”的可能性及其机制，癌症对于人体某种程度上只是一种慢性病的设想也因此得到支持。
从以上分析可以总结出以下几方面：1）癌症长期生存者日常的自控锻炼是一种中等强度的有氧锻炼，这种形式和负荷的锻炼增加体内自由基的产生，但这种影响可能仍处于不产生器质性损害的稳态水平；2）坚持这种锻炼在对抗氧化酶活性的影响上存在差异，它提高了血清SOD、T-AOC水平，增强了抗氧化防御能力；3）长期锻炼促进人体对氧化应激的适应除调节抗氧化酶对自由基的反应来实现外，提高机体对自由基活动的耐受能力和适应能力可能也是机制之一。
4 小结
长期规律自控锻炼者血清SOD、T-AOC活性和MDA含量均高于不锻炼者，提示锻炼者体内氧化应激处于较高代谢速率的动态平衡状态。
致谢：感谢上海市癌症康复学校对本研究的组织和实施过程中的大力支持与帮助！感谢美国伊利诺伊斯大学朱为模教授对本课题的关心、指导和无私帮助！
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